Sa marraine est Lillian Gish, les acteurs : Harpo Marx, Robert Benchley, Béatrice Lillie, John Barrymore">John Barrymore, sont souvent les invités de ses parents.

C’est donc tout naturellement qu’il débute à l’âge de 8 ans sur scène avec sa mère adoptive Helen Hayes. Ses études se déroulent à la Allen-Stevenson School de New York, puis à la Solebury School de New Hope, en Pennsylvanie. Durant ses années de lycée, il excelle au football, au baseball et au basketball. Il participe également à la section dramatique du campus et se produit sur scène lors des productions estivales scolaire.

Très vite, James MacArthur abandonne ses études et se retrouve à 18 ans dans l’épisode «Deal a blow» (1955) de la série télévisée « Climax » de John Frankenheimer, où il incarne un adolescent incompris, en conflit avec ses parents et la loi.

John Frankenheimer adapte ce drame familial au grand écran sous le titre « Mon père cet étranger » (1957) et engage le jeune acteur pour tenir le même rôle, celui d’un adolescent rebelle et amer, avec James Daly jouant son père et Kim Hunter sa mère. Sa performance lui à valu à une nomination au British Academy of Film and Television Arts Film Award en tant que nouveau venu le plus prometteur.

James MacArthur et Stefanie Powers. Dans le film de 1962 : Les Internes

Autre rôle marquant, dans « La lueur dans la forêt » (1958) de Herschel Daugherty, celui d’un enfant blanc capturé et élevé par les indiens, il affronte avec difficultés son retour dans sa famille d’origine, Joanne Dru, Fess Parker et Wendell Corey se partagent les rôles principaux.

Citons aussi le film d’aventure « Les Robinsons des mers du Sud » (1959) de Ken Annakin, où il est le fils de John Mills et Dorothy McGuire, naufragés sur une île déserte, qui tentent de survivre et de faire face à un groupe de pirates.

Cette même année, il reçoit un Theatre World Award pour son rôle d’Aaron Jablonski dans la pièce de Broadway « Invitation to a March » d’Arthur Laurents.

Citons aussi sa présence dans l’épisode « Death for Sale » (1961) de la série « Les incorruptibles » où pour la première fois il dépeint un personnage antipathique celui de Johnny Lubin un sociopathe qui joue au jeu mortel du chat et de la souris avec Eliot Ness et ses hommes. Une performance qui a fourni la preuve de ses capacités d'acteur aux multiples facettes et talentueux.

Il est ensuite le fils aîné de Henry Fonda et de Maureen O’Hara, dans le drame familial de Delmer Daves « La montagne des neuf Spencer » (1962) avec Mimsy Farmer, Donald Crisp et Virginia Gregg.

Il est engagé dans quelques films de guerre dont « Une fille dans la bataille » (1963) de Irving Lerner, où lors de la Seconde Guerre mondiale, il se retrouve impliqué dans une guérilla contre les Japonais aux Philippines, blessé il est recueilli dans un village et soigné par une jeune fille nommée Sisa (Rita Moreno) et en tome amoureux.

Ken Annakin lui confie la responsabilité de diriger une patrouille de soldats bien déterminés à en découdre dans la « La bataille des Ardennes » (1965) avec une pléiade d’acteurs comme entre autres, Henry Fonda, Robert Shaw, Robert Ryan, Charles Bronson et Dana Andrews. Et pour James B. Harris dans « Aux postes de combat » (1965) il campe l’enseigne Ralston à bord d’un destroyer de la Marine américaine qui traque un sous-marin soviétique lors de la Guerre froide avec Richard Widmark et Sidney Poitier.

Dans « Les Maraudeurs de Mosby » (1966) de Michael O’Herlihy, lors de la guerre civile américaine il tient le rôle du caporal Jenkins de l'armée de l'Union qui participe à l'enlèvement d'un Général nordiste avec Nick Adams et Kurt Russell, et celui du prédicateur itinérant dans le western de Ted Post, « Pendez-les haut et court » (1967) avec Clint Eastwood et Inger Stevens.

Peu de films ont jalonnés sa carrière au cinéma, il fut davantage omniprésent à la télévision, on l’aperçoit jusqu’en 1998 dans diverses séries où les westerns et les drames policiers ont dominé la phase suivante de la carrière. Sa célébrité au petit écran vient principalement avec la série télévisée « Hawaï Police d’Etat » qui fit les beaux jours des téléspectateurs durant douze saisons de 1968 à 1990, il interprète le détective Danny Williams, adjoint de Jack Lord, alias le lieutenant McGarrett où ils poursuivent des voleurs, des tueurs à gages, des escrocs, des espions et des fous assortis. Citons aussi « Bonanza » (1959), « Gunsmoke » (1955), « Combat! » (1962), « 12 O'Clock High » (1964), « Le Virginien » (1965), « Hondo » (1967), « Beyond Vengeance » (1966), « 12 O'Clock High » (1966), « Hang 'Em High (1968), « L’île fantastique » (1978), « La croisière s’amuse » (1979) où encore « Arabesque » (1984).

En fin de carrière, il s'est produit aussi sur scène pendant un certain temps dans des productions telles que « Arsenic and Old Lace », ou « A Bedfull of Foreigners ».

Grand amateur de sport il apparaît occasionnellement en direct, lors d'événements sportifs caritatifs et de célébrités.

Coté vie privée ; James MacArthur a été marié trois fois, un premier mariage avec l’actrice Joyce Bulifant en 1958, suivi d’un divorce en 1967. En 1970 il rencontre et épouse sur l’île hawaïenne de Kauai l’actrice Melody Patterson, nouveau divorce en 1975. Une dernière fois en 1984 avec une ancienne golfeuse Helen Beth Duntz. Ils sont restés unis jusqu’au décès de l’acteur le 28 octobre 2010 à l’âge de 72 ans des suites d’un cancer.

Quatre enfants sont nées de ses différents mariages.