Dès 1921, elle apparaît à Broadway et figure dans les revues musicales «The Grand Street Follies» et «Artists and Models». Elle poursuit sa carrière théâtrale pendant cinq dans un large éventail de personnages. Elle glane certains succès notables comme son rôle de Ruth Atkins, un personnage émouvant, dans «Beyond the Horizon» du dramaturge Eugene O’Neill.

Repérée par les dépisteurs de la Warner Boss, Aline MacMahon répond à l’appel des sirènes d’Hollywood en 1931, bien que son physique ne correspond pas vraiment à l’idéal hollywoodien. Elle est engagée dans « Five star final » (1931) de Mervyn LeRoy, pour être la secrétaire d’un rédacteur en chef interprété par Edward G. Robinson.

En 1932, dans le drame hospitalier « La vie commence » d’Elliott Nugent, elle reçoit de bonnes critiques pour son rôle d’une bienveillante infirmière en chef qui prend en charge une meurtrière sur le point d’accoucher. Dans « Chercheuses d’or » (1933) de Mervyn LeRoy, quatre actrices de music-hall débutantes, Ruby Keeler, Joan Blondell, Ginger Rogers et Aline MacMahon qui joue Trixie la comique de la bande poursuivent leurs rêves de devenir star à Broadway.

Dans le drame familial « Le monde change » (1933) Mervyn LeRoy relate l'ascension et de la chute d'une dynastie familiale du Midwest après plusieurs décennies avec Paul Muni un garçon de ferme ambitieux qui devient riche, mais gère mal son succès, avec Aline MacMahon et Mary Astor qui jouent respectivement sa mère et sa femme. Dans la comédie policière « While the patient slept » (1934) de Ray Enright elle campe une infirmière qui prête main-forte au lieutenant Lance O'Leary (Guy Kibbee) afin de démasquer le meurtrier du patient dont elle avait la charge.

Les années suivantes Aline MacMahon, la trentaine avérée se voit confier des rôles plus maternels, de mères, d'épouses, de nurses ou encore de tantes, tenant ses personnages avec un esprit vif et une langue acidulée. Telle la mère abusée qui hérite d'une fortune dans la comédie « La joyeuse famille » (1934) d’Alfred E. Green, seule condition pour hériter elle doit abandonner sa famille de mauvais payeurs, mais les membres de sa famille tels des rapaces tentent de se réformer dans le but de profiter de son héritage. Dans le drame policier « La marque du destin » (1938) de William K. Howard, elle campe Mlle Williams un professeur à la retraite, pour remercier ses anciens élèves elle envoie des cartes et des cadeaux à ses élèves, dont Frankie (Wallace Ford) son protégé, un jeune délinquant en mal de vivre dont le père alcoolique dépense le peu de revenu en boisson.

Après « Le cabaret des étoiles » une comédie musicale sur fond de guerre de Frank Borzage où elle fait une simple apparition parmi un casting impressionnant, elle franchit la frontière du film dramatique et montre la profondeur de son talent dans « Les fils du dragon » (1944) de Harold S. Bucquet, elle y est la mère de Jade Tan, (Katharine Hepburn) qui entraîne ses concitoyens dans un soulèvement contre les envahisseurs japonais. Pour sa prestation, Aline est nommée pour l’Oscar du meilleur second rôle féminin, mais la statuette est décernée cette année-là à Ethel Barrymore.

Aline MacMahon, Joan Blondell et Ruby Keeler - Dans le film de 1933 : Chercheuses d'or de 1933

Elle campe la mamie Steeple dans le policier « L’invincible McGurk » (1946) de John Waters avec Wallace Beery dans le rôle titre un ancien champion de boxe qui a des sentiments paternels pour adopter un garçonnet, avec Cameron Mitchell et Edward Arnold.

En 1948, Fred Zinnemann lui offre un rôle émouvant dans « Les anges marqués », où dans l’après guerre à Berlin, Jarmila Novotna, la mère d’une jeune garçon de neuf se rend au camp de l'UNRRA dirigé par Aline McMahon, pour retrouver son enfant perdu dans une Allemagne en ruine, c’est le GI Stevenson (Montgomery Clift), qui trouve l’enfant survivant du camp de concentration d’Auschwitz et qui le ramène à sa mère. Elle apparaît aussi dans les westerns comme « L’homme de la plaine » (1955) avec James Stewart et « La ruée vers l’Ouest » (1960) avec Glenn Ford, tous les deux d’Anthony Mann.

Dans la romance exotique « Le seigneur d’Hawaii » (1962) de Guy Green, elle est Kapiolani Kahana la mère de Dean Kahana (George Chakiris) avec Charlton Heston un seigneur qui s’oppose au mariage de sa sœur Yvette Mimieux avec Dean un jeune homme des îles d'un important propriétaire d'Hawaï.

Dans « L’ombre du passé » (1962) un drame musical de Ronald Neame, Aline MacMahon est la costumière de la chanteuse populaire Jenny Bowman (Judy Garland) qui se rend à Londres pour un grand spectacle au Palladium, elle y retrouve son fils Matt (Gregory Phillips) et son ancien amant David Donne (Dirk Bogarde) avec qui elle a eu son fils 14 ans plus tôt.

En 1963, elle signe son dernier passage au grand écran, jouant la tante Hannah dans le drame familial d’Alex Segal «All the way home» où Jean Simmons et Robert Preston se partagent les rôles principaux. Après ces triomphes bien mérités, elle joue les guets stars dans diverses émissions télévisées et poursuit sa carrière théâtrale, jusqu’en 1975, apparaissant dans une dizaine de pièces dont « Galilée » (1967), « Cyrano de Bergerac » (1968) ou encore « Trelawney of the Wells » (1975). Cette même année 1975, elle perd son mari épousé en 1928, l’architecte et urbaniste Clarence S. Stein un des principaux promoteurs du mouvement Garden City aux États-Unis.

Aline MacMahon et Loretta Young - Dans le film de 1932 : La vie commence

Aline MacMahon décède à son domicile new-yorkais, le 12 octobre 1991 à l’âge de 92 ans des suites d’une pneumonie. Elle était la cousine germaine du cinéaste S. Sylvan Simon.