Elle fait ses débuts dans la musique en 1934 comme danseuse dans la troupe du Cotton Club, célèbre cabaret de Harlem où elle devient chanteuse trois ans plus tard, accompagnée par l'orchestre de Charlie Barnet. Lena Horne se fait ensuite remarquer sur Broadway et entame une carrière cinématographique.

Après un faux départ dans un film musical parlant de 1938, intitulé "The Duke is Tops", Horne est la première femme Afro-Américaine à signer un contrat de longue durée avec un studio d'Hollywood, la Metro-Goldwyn-Mayer. Elle y fait ses débuts en 1942 dans Panama Hattie et devient célèbre en 1943 pour son interprétation de Stormy Weather dans le film du même nom. Elle apparaît ensuite dans de nombreuses comédies musicales de la MGM, toutefois elle n'aura que peu de premier rôle du fait de sa couleur de peau, par peur du boycott dans des États du Sud, où les cinémas refusaient de donner des films ainsi distribués. La seule exception notable est Cabin in the Sky (1943), bien qu'une des parties de son corps y soit coupée car considérée comme trop suggestive par les censeurs. Elle manque de jouer le rôle Julia LaVerne dans la version de 1951 de Show Boat qui échoit finalement à Ava Gardner.

Horne épouse Lennie Hayton, un juif américain. Hayton est l'un des premiers chefs d'orchestre, arrangeurs de la MGM. Le mariage perdure jusqu'à la mort de Hayton en 1971, en dépit d'un environnement hostile. En effet, les directeurs exécutifs des studios désapprouvent cette union inter-raciale et le couple est mis au ban. Dans sa biographie co-écrite avec Richard Schickel, Horne raconte les pressions énormes et les injures qu'ils durent subir.

Dans les années cinquante, le couple est accusé d'activités anti-américaines" ce qui vaudra à Lena Horne une traversée du désert émaillée de quelques disques qu'elle parvient tout de même à enregistrer pour la RCA. C'est en 1957 et grâce à la revue Jamaïca qu'elle renoue avec le succès. Elle enchaînera avec des tournages et un certain nombre de revues jusque dans les années 1970.

Elle fait un retour dans les années 1990 avec deux albums enregistrés pour le label Blue Note.

Son étoile se trouve au Walk of Fame au numéro 6282 sur Hollywood Boulevard.