De son véritable nom Robert Ozell Moseley, Guy Madison passe sa jeunesse à Bakersfield où il fait ses études avant de se lancer dans la vie active comme installateur de lignes téléphoniques. En 1942, peu de temps après l'entrée des états-unis dans la seconde guerre mondiale, il s'engage dans la marine américaine qui l'utilise comme garde-côte. En 1944, alors qu'il passe un week-end de permission à Hollywood, il assiste à un show radiodiffusé et se fait remarquer, dans le public, par un assistant d'Henry Willson, un proche collaborateur de David O. Selznick qui vient de créer la société de production Vanguard. Henry Willson, réputé pour son écurie de jeunes acteurs talentueux, recherche à ce moment là un jeune inconnu pour tenir le rôle, très secondaire mais important dans l'histoire, d'un matelot, pour le film en préparation "Since You Went Away".

David O. Selznick engage le jeune homme et Henry Willson le rebaptise aussitôt du nom d'acteur qu'on lui connait, Guy Madison. Sa scène est tournée durant un week-end de permission et Guy retourne ensuite à son travail de garde-côtier pour la marine nationale. La même année, le film sort sur les écrans et les studios reçoivent aussitôt des milliers de lettres de fan qui veulent en savoir plus sur ce jeune acteur qui interprète le rôle du mâtelot.

La guerre terminée, Guy Madison retourne à Hollywood et découvre qu'il est une star en devenir. Mais son amateurisme dans le métier d'acteur ne suffira pas à le propulser au rang de star, et il décide d'étudier et de travailler dans le théatre. En 1946, il est engagé par la R. K. O. et apparait dans plusieurs films, touchant un peu à tous les genres, comédie, romantique, drame. Ce n'est qu'en 1949 qu'il fait sa première approche avec un genre qui marquera fortement sa carrière, le western, avec "La Rivière Des Massacres" dans lequel il partage l'affiche avec un autre grand acteur en devenir du western, Rory Calhoun. En 1951, il se voit proposer le rôle principal d'une série, "Les Aventures De Wild Bill Hickok", qui lui apporte la consécration et qui le place au rang de star dans le coeur des amateurs du genre.

Il va traverser ainsi les années 50, en alternant différents genres, mais en fesant du western de série B, son cheval de bataille qui occupe la majeure partie de sa filmographie. On le retrouve également en guest star dans quelques séries western telles que "Wagon Train" ou "Death Valley Days" jusqu'au début des années 60. Mais dès 1963, face à une carrière qui stagne, Guy Madison s'expatrie en Europe où il parvient à relancer sa carrière et à devenir une grande star.

Il promène alors sa silhouette de cowboy dans des productions italiennes ou espagnoles, et c'est ainsi qu'on le retrouve, en 1964, dans un des épisodes de Winnetou, "Les Cavaliers Rouges". Durant presque 10 ans, il va tourner en Europe, avant de revenir aux états-unis où, malheureusement, sa carrière ne redémarrera jamais. En 1988, il décide de clore celle-ci sur un western, un remake TV de "La Rivière Rouge", aux côtés de quelques anciennes star du genre comme James Arness et Clayton Moore. Il décédera 8 ans plus tard, en 1996 et sera enterré à Forest Lawn Cemetery, en Californie.

Pour sa contribution à l'industrie du cinéma, deux étoiles lui ont été attribuées sur le Hollywood Walk Of Fame, une pour la radio, et une seconde pour la télévision.