Pendant ses études secondaires, l’adolescente est devenue membre du chœur de la St. Louis Municipal Opera Company (connue sous le nom de The Muny. Parallèlement elle poursuit ses études supérieures dans l’Ohio, au Muskingum College, et obtient un baccalauréat en biologie, puis un doctorat en littérature.

Diplôme en poche elle enseigne durant cinq ans à l’Université Winconsin (où son père a obtenu un pastorat à Reedsburg) . Puis, elle s’installe à New York et décide de devenir comédienne, son argent gagné lui permet d'entrer à l'American Academy of Dramatic Arts à New York.

C’est d’abord un passage à la radio où elle sera une véritable vedette de radio roman, on l'entend dans des programmes comme « The Shadow » et des dramatiques radiophoniques « Sorry, Wrong Number » et le fameux « Raccrochez, c'est une erreur » où elle s'avère hallucinante. En 1933, elle rencontre Orson Welles, et contribue à la célèbre émission « La guerre des mondes ». Avec Welles elle crée le Mercury Theater Company en compagnie de Joseph Cotten, John Houseman et Everett Sloan. La troupe fera plusieurs tournées avant de s'installer définitivement à New York.

En 1941, la troupe décide de réaliser un film pour le grand écran, « Citizen Kane » une superproduction quasi-biographique racontant l'histoire du journaliste Charles Foster Kane incarné par Orson Welles, un grand magnat de la presse personnage mégalomane, égoïste et solitaire tandis que Agnès joue sa mère, une femme cruelle et amère Le film sera nommé aux Oscars dans neuf catégories.

Elle enchaîne avec « La splendeur des Amberson » (1942) signé Orson Welles elle est la tante Fanny, une femme aigrie qui assiste à la déchéance progressive de la famille des Ambersons, motivés par l’amour, la jalousie et la haine, sa prestation lui vaut le prix de la meilleure actrice attribué par la critique new-yorkaise ainsi qu'une première nomination aux Oscars comme actrice de soutient. Elle obtient un second Golden Globe du meilleur second rôle féminin pour son personnage de la baronne Aspasia Conti, la maîtresse de Walter Pidgeon face à Greer Carson dans « Mrs Parkington » (1943) de Tay Garnett ; puis John Cromwell lui donne un rôle pas très avouable celui d’une garce auprès de son amie Claudette Colbert dans « Depuis ton départ » (1944).

Avec la maturité, sa silhouette revêche au visage osseux, son regard glacial la cantonnent aux personnages de mégère ou de vieille fille, hystérique et frustrée comme en témoigne la tante acariâtre de la petite orpheline Jane (Peggy Ann Garner) dans « Jane Eyre » 1944 et la tante menaçante de la jeune Belinda (Jane Wyman) qui est sourde et muette mais elle s'humanise en constatant le courage de sa nièce dans le mélodrame « Johnny Belinda, l’enfant du silence » (1948) de Jean Negulesco, pour sa prestation elle obtient une troisième nomination aux Oscars. Elle devient une meurtrière sexy dans « Les passagers de la nuit » (1947) de Delmer Daves avec le point culminant du film où elle meurt en tombant d’une fenêtre avec Hunphrey Bogard et Lauren Bacall.

Elle est totalement méconnaissable dans « Moments perdus » (1947) de Martin Gabel elle incarne une femme vieille de 105 ans qui vit recluse avec sa nièce (Susan Hayward) dans une lugubre demeure à Venise qui détient des lettres d’amour qu’un célèbre poète voudrais possédait (Robert Cummings) mais d'étranges phénomènes interviennent. Basé sur un événement réel, Henry Hathaway réalise « Quatorze heures » (1950), Agnès Moorehead joue la mère névrotique du suicidaire Richard Basehart qui se tient sur un rebord d'un immeuble et menace de se jeter dans le vide .

Au milieu des années cinquante, ses rôles à l'écran sont plus remarquables par leur variété que par leur profondeur dramatique, citons ; « Le cygne » de Charles Vidor elle joue une reine acariâtre face à Grace Kelly, La princesse Alexandra et Alec Guinness Le prince Albert ; la mère de Montgomery Clift dans « L’arbre de vie » (1958) de Edward Dmytryk avec Elizabeth Taylor et Eva Marie Saint ; une hypocondriaque dans « Pollyanna» (1960) de David Swift avec Hayley Mills et Jane Wyman ; une mère pionnière dans le western « La conquête de l’Ouest » (1963) de Henry Hathaway; avec une brillante distribution citons entre autres Gregory Peck , Richard Widmark, Henry Fonda, John Wayne, James Stewart, Debbie Reynolds et Carroll Baker.

Un autre moment décisif dans sa carrière où elle est pour la cinquième fois nominée à l'Oscar et obtient son deuxième Golden Globe Award pour sa brillante performance d’une femme de chambre souillonne de Bette Davis dans le film d'épouvante « Chut, chut, chère Charlotte » (1964) de Robert Aldrich. Cette même année 1964, elle est choisie pour incarner Endora, la mère sarcastique et acariate de Samantha Steven (Elizabeth Montgomery) dans la série télévisée « Ma sorcière bien-aimée » mettant un frein d’arrêt à sa carrière au théâtre et au cinéma.

Mariée en 1930 à l'acteur John Griffith Lee; ils divorcent un an après avoir adopté en 1952 un garçon nommé Sean, elle épouse ensuite l'acteur Robert Gist en 1954, une union qui se termine aussi par un divorce en 1958.

Agnès Moorehead est décédée d'un cancer de l'utérus le 30 avril 1974 à Rochester, Minnesota, à l'âge de 73 ans, elle repose dans une crypte au Dayton Memorial Park à Dayton dans l’Ohio.

Selon certaines sources , ce serait en tournant le film « Le conquérant » (1956) de Dick Powell dans l’Utah près de Yucca Flat, le terrain des essais nucléaires de l'armée, qu’elle aurait peut-être développé un cancer à cause des retombées radioactives des essais nucléaires atmosphériques de l'armée. Plusieurs membres de la production : entre autre John Wayne, Susan Hayward , Pedro Armendáriz (décédé par suicide) et le réalisateur Dick Powell , ont étés victimes plus tard d’un cancer ou à des maladies liées au cancer La distribution et l'équipe à totalisée 220 personnes. À la fin de 1980, selon le magazine People, 91 d'entre eux avaient développé une forme de cancer et 46 étaient morts de la maladie…